Produktai
Lifecosm SARS-Cov-2-RT-PCR aptikimo rinkinys, skirtas 2019-nCoV
Numatomas panaudojimas
Šis rinkinys naudojamas kokybiniam naujo koronaviruso (2019-nCoV) aptikimui naudojant gerklės tamponus, nosiaryklės tamponus, bronchoalveolių plovimo skystį, skreplius. Šio produkto aptikimo rezultatas yra tik klinikinė nuoroda, todėl jis neturėtų būti naudojamas kaip vienintelis klinikinės diagnozės ir gydymo įrodymai.Rekomenduojama atlikti išsamią būklės analizę kartu su paciento klinikinėmis apraiškomis ir kitais laboratoriniais tyrimais.
Patikrinimo principas
Rinkinys pagrįstas vieno žingsnio RT-PGR technologija.Tiesą sakant, 2019 m. naujojo koronaviruso (2019-nCoV) ORF1ab ir N genai buvo pasirinkti kaip amplifikacijos tiksliniai regionai.Specifiniai pradmenys ir fluorescenciniai zondai (N geno zondai pažymėti FAM, o ORF1ab zondai – HEX) yra skirti 2019 m. naujo tipo koronaviruso RNR aptikti mėginiuose.Rinkinyje taip pat yra endogeninė vidinės kontrolės aptikimo sistema (vidinės kontrolės geno zondas, pažymėtas CY5), skirtas stebėti mėginių paėmimo, RNR ir PGR amplifikacijos procesą, taip sumažinant klaidingai neigiamus rezultatus.
Pagrindiniai komponentai
| Komponentai | Apimtis(48T/Kit） |
| RT-PGR reakcijos tirpalas | 96 µl |
| nCOV pradmenų TaqMan zondo mišinys (ORF1ab, N genas, RnaseP genas) | 864 µl |
| Neigiama kontrolė | 1500 µl |
| nCOV teigiama kontrolė (l ORF1ab N genas) | 1500 µl |
Nuosavi reagentai: RNR ekstrahavimo arba gryninimo reagentai.Neigiama/teigiama kontrolė: teigiama kontrolė yra RNR, turinti tikslinį fragmentą, o neigiama kontrolė yra vanduo be nukleorūgščių.Naudojimo metu jie turėtų dalyvauti ekstrahavimo procese ir turėtų būti laikomi užkrečiamais.Jie turi būti tvarkomi ir šalinami laikantis atitinkamų taisyklių.
Vidinis etaloninis genas yra žmogaus RnaseP genas.
Laikymo sąlygos ir galiojimo laikas
-20±5 ℃, venkite pakartotinio užšaldymo ir atšildymo daugiau nei 5 kartus, galioja 6 mėnesius.
Taikoma priemonė
Su FAM / HEX / CY5 ir kitu daugiakanaliu fluorescenciniu PGR prietaisu.
Pavyzdžio reikalavimai
1. Taikomi mėginių tipai: gerklės tamponai, nosiaryklės tamponai, bronchoalveolių plovimo skystis, skrepliai.
2. Mėginių paėmimas (aseptinė technika)
Ryklės tamponas: nuvalykite tonziles ir užpakalinę ryklės sienelę dviem tamponais vienu metu, tada panardinkite tampono galvutę į mėgintuvėlį, kuriame yra mėginio ėmimo tirpalas.
Skrepliai: po to, kai pacientas stipriai kosėja, surinkite atkosėtus skreplius į užsukamąjį dangtelį mėgintuvėlį, kuriame yra mėginio ėmimo tirpalas;Bronchų alveolinis plovimo skystis: mėginius paima medicinos specialistai.3.Mėginių laikymas ir transportavimas
Mėginiai viruso išskyrimui ir RNR tyrimui turi būti ištirti kuo greičiau.Mėginiai, kuriuos galima aptikti per 24 valandas, gali būti laikomi 4 ℃ temperatūroje;kurių negalima aptikti per 24
valandos turėtų būti laikomos -70 ℃ arba žemesnėje temperatūroje (jei nėra -70 ℃ laikymo sąlygos, jos turėtų būti
laikinai laikomas -20 ℃ šaldytuve).Gabenant mėginius reikia vengti pakartotinio užšalimo ir atšildymo.Paėmus mėginius kuo greičiau reikia išsiųsti į laboratoriją.Jei mėginius reikia gabenti dideliais atstumais, rekomenduojama laikyti sausą ledą.
Bandymo metodai
1 Mėginio apdorojimas ir RNR ekstrahavimas (mėginio apdorojimo sritis)
RNR ekstrahavimui rekomenduojama paimti 200μl skysto mėginio.Apie susijusius ekstrahavimo veiksmus žr. komercinių RNR ekstrahavimo rinkinių instrukcijas.Ir neigiamas, ir neigiamas
šio rinkinio kontroliniai elementai buvo įtraukti į ekstrahavimą.
2 PGR reagento paruošimas (reagento paruošimo sritis)
2.1 Išimkite visus komponentus iš rinkinio ir atšildykite bei sumaišykite kambario temperatūroje.Prieš naudojimą keletą sekundžių centrifuguokite 8000 aps./min.;apskaičiuokite reikiamą reagentų kiekį ir reakcijos sistema paruošiama taip, kaip parodyta šioje lentelėje:
| Komponentai | N porcija (25 µl sistema) |
| nCOV grunto TaqMan zondo mišinys | 18 µl × N |
| RT-PGR reakcijos tirpalas | 2 µl × N |
| *N = ištirtų mėginių skaičius + 1 (neigiama kontrolė) + 1 (nCOVteigiama kontrolė) | |
2.2 Kruopščiai sumaišę komponentus, trumpą laiką centrifuguokite, kad visas skystis ant mėgintuvėlio sienelės nukristų į mėgintuvėlio dugną, tada supilkite 20 µl amplifikacijos sistemą į PGR mėgintuvėlį.
3 Mėginių ėmimas (mėginio paruošimo sritis)
Po ekstrahavimo įpilkite 5 μl neigiamos ir teigiamos kontrolės.Į PGR reakcijos mėgintuvėlį įpilama tiriamo mėginio RNR.
Tvirtai uždarykite mėgintuvėlį ir keletą sekundžių centrifuguokite 8000 aps./min., prieš perkeldami jį į amplifikacijos aptikimo sritį.
4 PGR amplifikacija (pastiprinta aptikimo sritis)
4.1 Įdėkite reakcijos mėgintuvėlį į instrumento mėginio kamerą ir nustatykite parametrus taip:
| etapas | Ciklas numerį | Temperatūra(°C) | Laikas | kolekcijasvetainę |
| Atvirkščiaitranskripcija | 1 | 42 | 10min | - |
| Išankstinė denatūracijan | 1 | 95 | 1 minutė | - |
| Ciklas | 45 | 95 | 15s | - |
| 60 | 30s | duomenų rinkimas |
Prietaiso aptikimo kanalo pasirinkimas: pasirinkite FAM, HEX, CY5 kanalą fluorescenciniam signalui.Referenciniam fluorescenciniam NONE, nesirinkite ROX.
5 Rezultatų analizė (Nustatymo ieškokite kiekvieno prietaiso eksperimentinėse instrukcijose)
Po reakcijos išsaugokite rezultatus.Atlikę analizę, pagal vaizdą pakoreguokite pradinę, pabaigos vertę ir slenkstinę bazinės linijos vertę (vartotojas gali koreguoti pagal faktinę situaciją, pradinė vertė gali būti nustatyta į 3–15, pabaigos vertė gali būti nustatyta į 5~20, koregavimas) logaritminiame grafike Ties lango slenksčiu slenksčio linija yra logaritminėje fazėje, o neigiamos kontrolės stiprinimo kreivė yra tiesi linija arba žemiau slenksčio linijos).
6 Kiekio kontrolė (Į bandymą įtraukta procedūrinė kontrolė) Neigiama kontrolė: nėra akivaizdžios FAM, HEX, CY5 aptikimo kanalų stiprinimo kreivės.
COV teigiama kontrolė: akivaizdi FAM ir HEX aptikimo kanalų stiprinimo kreivė, Ct vertė ≤32, bet nėra CY5 kanalo stiprinimo kreivės;
Pirmiau minėti reikalavimai turi būti tenkinami vienu metu atliekant tą patį eksperimentą;kitu atveju eksperimentas negalioja ir jį reikia pakartoti.
7 Rezultatų nustatymas.
7.1 Jei tiriamojo mėginio FAM ir HEX kanaluose nėra amplifikacijos kreivės arba Ct reikšmė > 40, o CY5 kanale yra amplifikacijos kreivė, galima spręsti, kad 2019 m. naujo koronaviruso (2019-nCoV) nėra. RNR mėginyje;
.2 Jei tiriamajame mėginyje FAM ir HEX kanaluose yra akivaizdžių amplifikacijos kreivių, o Ct vertė yra ≤40, galima spręsti, kad mėginys yra teigiamas 2019 m. naujajam koronavirusui (2019-nCoV).
7.3 Jei tiriamasis mėginys turi aiškią stiprinimo kreivę tik viename FAM arba HEX kanale, o Ct vertė yra ≤40, o kitame kanale stiprinimo kreivės nėra, rezultatus reikia patikrinti iš naujo.Jei pakartotinio tyrimo rezultatai yra nuoseklūs, galima nuspręsti, kad mėginys yra teigiamas
koronavirusas 2019 (2019-nCoV).Jei pakartotinio tyrimo rezultatas yra neigiamas, galima spręsti, kad mėginys yra neigiamas dėl 2019 m. naujojo koronaviruso (2019-nCoV).
Teigiama sprendimo vertė
ROC kreivės metodas naudojamas rinkinio etaloninei CT vertei nustatyti, o vidinės kontrolės etaloninė vertė yra 40.
Testo rezultatų interpretavimas
1. Kiekvienas eksperimentas turi būti patikrintas, ar nėra neigiamų ir teigiamų kontrolinių mėginių.Bandymų rezultatus galima nustatyti tik tada, kai kontrolė atitinka kokybės kontrolės reikalavimus
2. Kai FAM ir HEX aptikimo kanalai yra teigiami, CY5 kanalo (vidinio valdymo kanalo) rezultatas gali būti neigiamas dėl sistemos konkurencijos.
3. Kai vidinės kontrolės rezultatas yra neigiamas, jei mėgintuvėlio FAM ir HEX aptikimo kanalai taip pat yra neigiami, reiškia, kad sistema išjungta arba veikia neteisingai, t testas negalioja.Todėl mėginius reikia ištirti iš naujo.
