Produktai
„Lifecosm“ SARS-Cov-2-RT-PGR aptikimo rinkinys 2019-nCoV
Numatomas naudojimas
Šis rinkinys naudojamas kokybiniam naujojo koronaviruso (2019-nCoV) nustatymui naudojant gerklės tepinėlius, nosiaryklės tepinėlius, bronchoalveolinio lavažo skystį, skreplius. Šio produkto aptikimo rezultatas yra tik klinikinės informacinės paskirties ir neturėtų būti naudojamas kaip vienintelis klinikinės diagnozės ir gydymo įrodymas. Rekomenduojama atlikti išsamią būklės analizę kartu su paciento klinikinėmis apraiškomis ir kitais laboratoriniais tyrimais.
Tikrinimo principas
Rinkinys pagrįstas vieno etapo RT-PGR technologija. Iš tikrųjų, 2019 m. naujojo koronaviruso (2019-nCoV) ORF1ab ir N genai buvo pasirinkti kaip amplifikacijos taikiniai. Specifiniai pradmenys ir fluorescenciniai zondai (N geno zondai žymimi FAM, o ORF1ab zondai – HEX) yra skirti 2019 m. naujojo tipo koronaviruso RNR aptikimui mėginiuose. Rinkinyje taip pat yra endogeninė vidinės kontrolės aptikimo sistema (vidinės kontrolės geno zondas, žymimas CY5), skirta stebėti mėginių surinkimo, RNR ir PGR amplifikacijos procesą, taip sumažinant klaidingai neigiamų rezultatų skaičių.
Pagrindiniai komponentai
| Komponentai | Tūris()48T/Kit) |
| RT-PGR reakcijos tirpalas | 96 µl |
| nCOV pradmenų TaqMan zondo mišinys (ORF1ab, N genas, RnaseP genas) | 864 µl |
| Neigiama kontrolė | 1500 µl |
| nCOV teigiama kontrolė (l ORF1ab N genas) | 1500 µl |
Nuosavi reagentai: RNR ekstrakcijos arba gryninimo reagentai. Neigiama/teigiama kontrolė: teigiama kontrolė yra RNR, kurioje yra tikslinis fragmentas, o neigiama kontrolė yra vanduo be nukleorūgščių. Naudojimo metu jie turėtų dalyvauti ekstrakcijoje ir turėtų būti laikomi užkrečiamais. Su jais reikia elgtis ir juos išmesti laikantis atitinkamų taisyklių.
Vidinis etaloninis genas yra žmogaus RnaseP genas.
Laikymo sąlygos ir galiojimo laikas
-20 ± 5 ℃, vengti pakartotinio užšaldymo ir atšildymo daugiau nei 5 kartus, galioja 6 mėnesius.
Taikoma priemonė
Su FAM / HEX / CY5 ir kitais daugiakanaliais fluorescenciniais PGR prietaisais.
Reikalavimai pavyzdžiams
1. Taikomi mėginių tipai: gerklės tepinėliai, nosiaryklės tepinėliai, bronchoalveolinis lavažo skystis, skrepliai.
2. Mėginių surinkimas (aseptinė technika)
Ryklės tamponas: dviem tamponais vienu metu nuvalykite tonziles ir užpakalinę ryklės sienelę, tada panardinkite tampono galvutę į mėgintuvėlį su mėginio tirpalu.
Skrepliai: Pacientui giliai kosėjus, surinkite kosedusį skreplį į užsukamu dangteliu užsegamą mėgintuvėlį su mėginių ėmimo tirpalu; bronchoalveolinis lavažo skystis：Mėginius ima medicinos specialistai. 3. Mėginių laikymas ir transportavimas
Mėginiai viruso išskyrimui ir RNR tyrimui turėtų būti ištirti kuo greičiau. Mėginiai, kuriuos galima aptikti per 24 valandas, gali būti laikomi 4 °C temperatūroje; tie, kurių nepavyksta aptikti per 24 valandas,
valandų turėtų būti laikomos -70 ℃ arba žemesnėje temperatūroje (jei nėra -70 ℃ laikymo sąlygų, jos turėtų būti
laikinai laikomi -20 ℃ šaldytuve). Transportavimo metu mėginius reikėtų vengti pakartotinio užšaldymo ir atšildymo. Mėginius reikia kuo greičiau nusiųsti į laboratoriją po surinkimo. Jei mėginius reikia transportuoti dideliais atstumais, rekomenduojama juos laikyti sausajame lede.
Bandymo metodai
1 Mėginių apdorojimas ir RNR išskyrimas (mėginių apdorojimo zona)
Rekomenduojama RNR ekstrakcijai paimti 200 μl skysto mėginio. Su ekstrahavimu susijusius veiksmus žr. komercinių RNR ekstrakcijos rinkinių instrukcijose. Tiek neigiamas, tiek neigiamas
Ekstrahavime dalyvavo šio rinkinio kontroliniai mėginiai.
2 PGR reagento paruošimas (reagento paruošimo zona)
2.1 Išimkite visus rinkinio komponentus, atšildykite ir sumaišykite kambario temperatūroje. Prieš naudojimą kelias sekundes centrifuguokite 8 000 aps./min. greičiu; apskaičiuokite reikiamą reagentų kiekį ir paruoškite reakcijos sistemą, kaip parodyta šioje lentelėje:
| Komponentai | N porcija (25 µl sistema) |
| nCOV pradmenų TaqMan zondo mišinys | 18 µl × N |
| RT-PGR reakcijos tirpalas | 2 µl × N |
| *N = tirtų mėginių skaičius + 1 (neigiama kontrolė) + 1 (nCOVteigiama kontrolė) | |
2.2 Kruopščiai sumaišius komponentus, trumpai centrifuguokite, kad visas skystis ant mėgintuvėlio sienelės nutekėtų į mėgintuvėlio dugną, tada 20 µl amplifikacijos sistemos supilkite į PGR mėgintuvėlį.
3 Mėginių ėmimas (mėginių paruošimo vieta)
Po ekstrakcijos įpilkite po 5 μl neigiamos ir teigiamos kontrolinių mėginių. Tiriamo mėginio RNR įpilama į PGR reakcijos mėgintuvėlį.
Sandariai uždarykite mėgintuvėlį ir centrifuguokite 8000 aps./min. greičiu kelias sekundes, prieš perkeldami jį į amplifikacijos aptikimo sritį.
4 PGR amplifikacija (amplifikuota aptikimo sritis)
4.1 Įdėkite reakcijos mėgintuvėlį į prietaiso mėginių kamerą ir nustatykite parametrus taip:
| scena | Ciklas skaičius | Temperatūra(°C) | Laikas | kolekcijasvetainė |
| Atvirkštinėtranskripcija | 1 | 42 | 10 min. | - |
| Priešdenatūravimasn | 1 | 95 | 1 min. | - |
| Ciklas | 45 | 95 | 15 sekundžių | - |
| 60 | 30-ieji | duomenų rinkimas |
Prietaiso aptikimo kanalo pasirinkimas: Fluorescenciniam signalui pasirinkite FAM, HEX, CY5 kanalą. Etaloniniam fluorescenciniam signalui NONE (JOKIO) kanalo nepasirinkite ROX.
5 Rezultatų analizė (Nustatymus žr. kiekvieno prietaiso eksperimentinėse instrukcijose)
Po reakcijos išsaugokite rezultatus. Po analizės logaritminiame grafike pakoreguokite pradinę, galutinę ir slenkstinę bazinės linijos vertes pagal vaizdą (vartotojas gali koreguoti pagal faktinę situaciją, pradinę vertę galima nustatyti nuo 3 iki 15, galutinę vertę – nuo 5 iki 20, koreguojant). Ties lango slenksčiu slenksčio linija yra logaritminėje fazėje, o neigiamos kontrolės amplifikacijos kreivė yra tiesi linija arba žemiau slenksčio linijos.
6 Kokybės kontrolė (procedūrinė kontrolė įtraukta į tyrimą) Neigiama kontrolė: nėra aiškios FAM, HEX, CY5 aptikimo kanalų amplifikacijos kreivės.
COV teigiama kontrolė: aiški FAM ir HEX aptikimo kanalų amplifikacijos kreivė, Ct vertė ≤ 32, bet nėra CY5 kanalo amplifikacijos kreivės;
Aukščiau išvardyti reikalavimai turi būti įvykdyti vienu metu tame pačiame eksperimente; priešingu atveju eksperimentas bus negaliojantis ir jį reikės pakartoti.
7 Rezultatų nustatymas.
7.1 Jei tiriamojo mėginio FAM ir HEX kanaluose nėra amplifikacijos kreivės arba Ct vertė yra > 40, o CY5 kanale yra amplifikacijos kreivė, galima spręsti, kad mėginyje nėra 2019 m. naujojo koronaviruso (2019-nCoV) RNR;
.2 Jei tiriamojo mėginio FAM ir HEX kanalų amplifikacijos kreivės yra akivaizdžios, o Ct vertė yra ≤40, galima spręsti, kad mėginys yra teigiamas 2019 m. naujajam koronavirusui (2019-nCoV).
7.3 Jei tiriamojo mėginio aiški amplifikacijos kreivė matoma tik viename FAM arba HEX kanale, o Ct vertė yra ≤40, o kitame kanale amplifikacijos kreivės nėra, rezultatus reikia ištirti dar kartą. Jei pakartotinio tyrimo rezultatai yra nuoseklūs, mėginį galima laikyti teigiamu naujajam kanalui.
2019 m. koronavirusas (2019-nCoV). Jei pakartotinio tyrimo rezultatas neigiamas, galima laikyti, kad mėginys neigiamas 2019 m. naujojo koronaviruso (2019-nCoV) atžvilgiu.
Teigiama vertinimo vertė
ROC kreivės metodas naudojamas rinkinio etaloninei CT vertei nustatyti, o vidinės kontrolės etaloninė vertė yra 40.
Testo rezultatų interpretavimas
1. Kiekvienas eksperimentas turėtų būti tiriamas su neigiamomis ir teigiamomis kontrolėmis. Tyrimo rezultatus galima nustatyti tik tada, kai kontrolės atitinka kokybės kontrolės reikalavimus.
2. Kai FAM ir HEX aptikimo kanalai yra teigiami, CY5 kanalo (vidinio kontrolės kanalo) rezultatas gali būti neigiamas dėl sistemos konkurencijos.
3. Jei vidinės kontrolės rezultatas neigiamas, o mėgintuvėlio FAM ir HEX aptikimo kanalai taip pat neigiami, tai reiškia, kad sistema išjungta arba veikimas netinkamas, t testas negalioja. Todėl mėginius reikia ištirti iš naujo.
